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技術(shù)文章
一起來了解一下什么是金擔(dān)子素A
   金擔(dān)子素A(Aureobasidin A,AbA)是從絲狀真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分離出來的環(huán)酯肽類抗生素,具有很強的抗真菌能力。在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/ml)即可對酵母產(chǎn)生毒性。對其敏感的真菌種類包括:出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用機制在于AbA抑制了真菌生長所依賴的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干擾鞘脂合成,從而進一步殺死菌株。編碼IPC合成酶的基因研究較多的有來自釀酒酵母菌的AUR1 基因,以及構(gòu)巢曲霉的AURA基因,兩者具有同源性。通過對這些編碼基因進行突變即可使得菌株對AbA產(chǎn)生抗性,如AUR1-C基因。

  AbA非常適合用作陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標(biāo)記。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報告子。本品為溶于甲醇的AbA溶液,濃度為1 mg/ml。具體的工作濃度取決于宿主細胞的敏感度(見表1. AbA對各種酵母菌的低抑菌濃度(MIC))。

  金擔(dān)子素A的操作步驟(抗AbA的酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng))

  1)加入0.5 ml過夜培養(yǎng)的酵母到50 ml YPD培養(yǎng)基中(配方:1L液體培養(yǎng)基含有10g yeast extract,20g polypeptone, 20g D-glucose;固體培養(yǎng)基另外加入2%瓊脂;)。

  2)30℃培養(yǎng)約6小時,測定OD660為1~2。使用二倍體時,測定OD660為2~4。

  3)1,000×g離心5分鐘。

  4)用10 ml Solution A(配方:100 mM Lithium acetate,10 mM Tris-HCl pH 7.5,1 mM EDTA)懸浮沉淀,1,000×g離心5分鐘。

  5)用Solution A重懸沉淀,直到OD660為150。

  6)在管內(nèi)分取100 µl細胞懸浮液,30℃培養(yǎng)1小時。

  7)加入5 µg載體(環(huán)狀或線性DNA)和150 µg Carrier DNA,100℃加熱10分鐘,迅速冷卻。

  注:pAUR101需使用線性DNA進行轉(zhuǎn)化。使用環(huán)狀DNA會降低轉(zhuǎn)化效率甚至轉(zhuǎn)化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)化。

  8)加入850 µl Solution B(配方:取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解,需要現(xiàn)用現(xiàn)配),輕輕混勻。

  9)30℃培養(yǎng)30分鐘后,42℃培養(yǎng)15分鐘。

  10)室溫放置10分鐘。

  11)5,000 rpm離心1分鐘,用5 ml YPD培養(yǎng)基懸浮沉淀。

  12)30℃培養(yǎng)6小時~過夜。

  13)5,000~10,000 rpm離心,用1-10 ml 0.9% NaCl懸浮沉淀。

  14)在YPD選擇培養(yǎng)基平板(含有一定濃度的AbA,依菌株類型而定)上接種100 µl細胞懸液。30℃培養(yǎng)3-4天后轉(zhuǎn)化完成。

  15)挑取陽性轉(zhuǎn)化子,和/或測定轉(zhuǎn)化效率(以每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)來表示)。

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